东方蜜蜂线粒体DNA应用进展

摘要：[研究目的]为掌握线粒体DNA(mtDNA)在东方蜜蜂研究中的取得的进展。[方法]本文总结了蜜蜂血DNA结构特征、mtDNA标记己研究技术和东方蜜蜂非编码区和编码区标记的应用情况。[结果] RNAleu-COⅡ区和部分COⅡ区的酶切和测序均发现了丰富的多态性。RNAleu-COⅡ区和部分编码区标记能较好地解决泰国、菲律宾东方蜜蜂的种群遗传分化问题。根据RNAleu -COⅡ区的系统发育关系将东方蜜蜂分成5个类型，并推测了他们的地理发育关系。[结论]mtDNA标记是解决东方蜜蜂遗传学和进化学问题较好的标记，增加样本量和研究的区段能解决mtDNA存在的不足。

关键词：东方蜜蜂；线粒体DNA；遗传多样性；遗传分化

线粒体是真核细胞中进行能量代谢的细胞器，线粒体DNA(mtDNA）位于线粒体中，属核外遗传物质。mtDNA具有基因组小、多拷贝、基因排列简单、无重组、遵循母性遗传等特点，其快速进化区和慢速进化区镶嵌，许多片段存在多态性。在个性进化论和分子钟理论指导下，mtDNA被广泛用于分类、系统发育、生物地理学、种群遗传学和法医学研究。mtDNA 标记在西方蜜蜂的亚种分类、亚种系统发育、起源进化、生物地理学、种群遗传结构和非洲化蜜蜂等研究中得到广泛的应用。

通过文献研究，本文对东方蜜蜂 mtDNA 特征及其在东方蜜蜂的遗传多样性、遗传分化及东方蜜蜂生物地理学等研究应用进展进行归纳分析，并探讨本领域研究中存在的问题。

1 东方蜜蜂的mtDNA

目前西方蜜蜂 mtDNA 基因组已测序，但东方蜜蜂的 mtDNA 基因组尚未测序，根据mtDNA在近缘种间保守性，可以利用西方蜜蜂相应区域来研究东方蜜蜂 mtDNA。

1.1 东方蜜蜂mtDNA基因组结构

西方蜜蜂的线粒体基因组序列全长16343 bp，包括37个编码基因和2个非编码区，其物理结构已清楚(图1)。

东方蜜蜂的mtDNA基因组结构与西方蜜蜂相似。研究发现东方蜜蜂COⅡ、COⅢ的全序列与西方蜜蜂的相似性分别达80％以上。位于tRNAleu和COⅡ之间的非编码区为蜜蜂属特有，不同的种间存在长度差异，东方蜜蜂该非编码区约89～97 bp，比西方蜜蜂的要短圆。

1.2 东方蜜蜂mtDNA分子标记的特点

mtDNA 遵循母系遗传，一只蜜蜂就能代表整群蜂 mtDNA 特征，因此为遗传研究提供了一条高效的途径。mIDNA进化速率较快，适用于作种下阶元的分子标记，如 tRNAleu-COⅡ、ATPase6 - ATPase8、lrRNA、srRNA、COⅠ和COⅡ等用于解决东方蜜蜂种群遗传分化、遗传多样性、系统发育问题。

1.3 东方蜜蜂mtDNA分子标记的研究技术

mtDNA的研究技术主要是限制性酶切片段多态性(RFLP和序列分析。RFLP技术耗资少、节约时间，适于快速的大样本量分析。能产生多态性片段的酶数量少，而且只能反映酶切位点的变异，RFLP技术反映标记的遗传变异时有一定局限性。序列测序提供了更丰富的遗传信息，有取代RFLP的趋势，但目前序列分析成本较高。

2 mtDNA在东方蜜蜂遗传多样性研究中的应用

遗传多样性研究是种质资源保护和利用的理论依据。近年来东方蜜蜂种群分布范围萎缩，种群数量锐减，其遗传多样性研究倍受关注。

该领域的研究共同存在样本量小的问题，小样本量不能充分反映遗传多样性水平，所以在新近研究中不断有新单倍型发现，多样性研究还不够充分。

受分子生物学研究技术的限制，有限位点的研究，是否能够代表样本的遗传多样性水平还存有疑虑。位点的选择是解决该问题的技术关键。

2.1 东方蜜蜂tRNAleu-COⅡ量区多样性研究

tRNAleu-COⅡ区在东方蜜蜂种群遗传多样性研究中使用较多，不同分布区的东方蜜蜂中发现较多酶切类型和序列单倍型，反映了东方蜜蜂存在遗传多样性。

2.1.1 酶切类型多样性

目前发现DraI、BgⅢ、EcoRV、HaeⅢ、HinfⅠ、NdeⅠ在东方蜜蜂tRNAleu-COⅡ具有一定酶切片段多态性，Dral酶反映该区的多态性最好，应用较多。

利用DmⅠ酶切研究东方蜜蜂多样性取得较好效果。在中国大部分地区中华蜜蜂检测到4种类型，秦岭地区发现4种，其他各地区仅1种；在泰国全国范围发现了7种类型；在菲律宾47群东方蜜蜂检测到4种类型，其中有1种酶切类型与中国的相同。

其他酶类在不同地区的样本中反映的遗传多样性不够丰富。东南亚7个地区的27群东方蜜蜂中，泰国样本在BgⅢ、EcoRV、HaeⅢ、HinfⅠ、NdeⅠ等酶切位点上存在多态性，其中南部与北—中部蜜蜂在2个酶切位点上存在差异。越南样本仅在HinH存在多态性，台湾的蜜蜂仅在BdⅡ和HaeⅢ酶切位点上存在多态性。尼泊尔、日本本州岛样本经10个酶切后未发现长度多态性。

2.1.2 非编码区序列多样性

东方蜜蜂检测到的tRNAleu-COⅡ的非编码区序列变异类型较为丰富，共发现70余种单倍型。东南亚诸岛已发现40余种单倍型，新单倍型数据还在增加，比亚洲大陆单倍型种类丰富(表1)，这可能是岛屿间的生境异质和隔离导致东方蜜蜂分化。中国范围内东方蜜蜂已发现近40种单倍型，遗传多样性较丰富。Japan1型所占比例较大，其他单倍型所占比例均较少。日本样本中Japan1型比例高达98.9％，仅在对马岛和大岛各发现1种新单倍型，该区域的遗传多样性缺乏。

2.2 东方蜜蜂mtDNA编码区多样性研究

东方蜜蜂mtDNA编码区某些位点也具有一定的多态性，利用mtDNA编码区的多态性能够研究东方蜜蜂遗传多样性。泰国东方蜜蜂的ATPase6-ATPase8经TaqⅠ，VspⅠ和VspⅠ酶切，发现8种线粒体型，而对IrRNA基因的DmⅠ酶切，仅发现4种酶切类型。此外，中国东方蜜蜂COⅡ编码区序列发现了13种单倍型，其中秦岭地区东方蜜蜂多样性较丰富，后发现云南样本也存在一些变异。由于文献中的数据不充分，还不能对COⅡ遗传多样性数据进行比较分析。

3 mtDNA在东方蜜蜂遗传分化中的应用及存在的问题

东方蜜蜂分布于无数不连续、异质的生境，在长期进化过程中，不同地理种群在遗传结构上逐渐趋异，形成适应不同生境的地理种群，许多研究者利用mtDNA标记也证实了不同地区的东方蜜蜂存在遗传分化。

利用mtDNA标记分析，发现泰国不同地区东方蜜蜂的遗传结构存在较大分化。早先10个内切酶对tRNAleu-COⅡ研究，初步发现泰国南、北部的东方蜜蜂存在差异。随后对泰国北部、东北部、中部、泰国半岛、Phuket和Samui 6个地区东方蜜蜂的COⅠ-COⅡ区，srRNA，IrRNA，ATPase6-ATPase8片段进行酶切分析，发现克拉地峡以北、泰国半岛—Phuket、Samui的种群间遗传结构存在明显遗传分化，这一研究结果也得到了形态标记和微卫星标记研究结果的支持。

mtDNA标记分析也揭示菲律宾各岛间东方蜜蜂存在遗传分化。来自菲律宾47只样本采用tRNAleu-COⅡ的DmⅠ酶切，发现Luzon、Palawan和Visayan群岛—Mindanao的东方该区酶切类型存在遗传差异，这可能是更新世海平面上升后各岛间的东方蜜蜂因长期隔离形成种群遗传分化的结果间。

mtDNA标记作为较成熟分子标记，已经在遗传分化研究工作中发挥了较大的作用，但也存在一些问题。

3.1 研究范围较大，相对样本数较少

样本量对于遗传分化研究是非常重要的，可直接影响到实验结果。早期对东南亚东方蜜蜂遗传分化研究中所用到的样本量仅27群。到目前为止，很多研究中样本量依然很小，仍然没有达到30只/样点的基本要求，仅泰国东方蜜蜂研究所用的样本量基本满足要求，这个问题应该引起学者的注意。

3.2 mtDNA标记研究结果与其他分子标记技术研究的结果不一致

利用mtDNA标记分析泰国东北部同北部—中部的东方蜜蜂结果显示分化较弱或无分化，而微卫星标记证实他们有很强的分化；在菲律宾，根据非编码区研究认为Luzon的高海拔和低海拔之间、Visayan群岛和Mindanao之间无分化，而形态学研究认为他们均存在分化，从Visayan群岛发现新的单倍型的趋势来看，也支持Visayan群岛和Mindanao之间存在分化。根据非编码区分析结果，PalawM可能存在两个类群，而形态学数据仅支持一个类群。使用不同标记，可能会导致结果存在分歧，应综合分析多种遗传标记的遗传信息，得出更接近客观的结果。

4 mtDNA在东方蜜蜂生物地理学中应用

东方蜜蜂生物地理学主要研究该种的地理分布格局及该种在地理分布上形成的历史，根据tRNAlue-COⅡ非编码区的分子系统发育关系，可以对各岛屿间、岛屿—大陆间东方蜜蜂地理分布的历史进行推测。

东方蜜蜂的系统发育研究取得一定的进展。到目前为止，根据tRNAleu-COⅡ非编码区单倍型间进化关系，将东方蜜蜂分成5个类型：(1)亚洲大陆型(包括韩国、日本、印度南部、尼泊尔、缅甸、越南、老挝、柬埔寨、泰国北部)；(2)Sundaland型(包括马来半岛、马来西亚、印尼)；(3)Palawan型(仅Palawan岛)；(4)菲律宾型(包括Luzon、Mindanao、Visayan群岛)；(5)平原型(包括印度南部、斯里兰卡)。

根据tRNAleu-COⅡ非编码区系统发育关系，对亚洲各岛屿间、岛屿—大陆间东方蜜蜂分布格局的形成原因进行了推测。马来半岛、马来西亚、印尼各岛(合称Sunda板块)曾与亚洲大陆接触或仅以狭窄的水域相隔，两地的东方蜜蜂存在迁移和基因交流；随着海平面升高和板块挤压，Sunda板块与大陆逐渐隔开，Sunda板块分割成许多岛屿，阻碍东方蜜蜂的基因交流；Palawan 岛曾在中更新世借婆罗洲与亚洲大陆相接，而 Luzon、Mindanao、Visayan 群岛则从未与亚洲大陆接触过。进一步，Smith 认为冰川时期亚洲北部不适于东方蜜蜂生存，只有越南、老挝、柬埔寨这些地方(单倍型丰富)适合东方蜜蜂避难，避难后的东方蜜蜂才扩散到亚洲北部地区。

此外，来自中国北方、台湾、苏拉威西岛和桑义赫群岛的部分样本发现了非编码区严重缺失现象，对这些缺失的非编码区的起源、系统发育关系还无法解释，可能是独立进化的特例。

利用mtDNA标记研究不同分布区的东方蜜蜂系统发育关系和推测东方蜜蜂现今分布格局的发展历史的结果，在宏观尺度下是合理的。若要对东南亚的生物—地理发育历史客观合理认识，还需结合其他物种生物地理学资料来证实。

参考文献(略)

《中国蜂业》2009，59（5）

徐新建 周冰峰 朱翔杰 吴显达

福建农林大学蜂学学院