东方蜜蜂群体多样性研究进展

较深入研究蜜蜂属分类的人当属Ruttner 博士，他对蜜蜂属形态方面的多个指标进行了分析，此后很多人应用他提供的分类体系对特定区域或品种的蜜蜂形态特征进行研究。由于自然环境因素、蜂群内部环境以及饲养管理手段等方面的影响，造成蜜蜂种内的亚种或地理宗的个体间在外部形态上往往比较相似，给种内的分类鉴别带来困难；又由于蜜蜂的生物学特点，必须以群为单位进行大样本数和有效的统计学分析，使其成为一种繁重、低效的研究工作，所以利用形态特征进行分析有很大的局限性。酶的多态性在对西方蜜蜂的研究中应用比较多，目前只是对少数地区(巴基斯坦、泰国、马来西亚、日本、菲律宾和朝鲜等)的东方蜜蜂进行了同功酶方面的分析，并且只是研究MDH(苹果酸脱氢酶)和EST(酯酶)的差别。至于我国的东方蜜蜂，仅对云南的样本做过该方面研究。由于同功酶的特异性较差，此方法现在应用较少。

近年来，随着蜜蜂遗传学和分子生物技术的发展，很多研究者已从分子水平上对蜜蜂群体进行研究。从分子水平上分析蜜蜂群体的遗传差异，目前主要采用DNA分子标记技术，如RAPD、DNA指纹图谱、微卫星多态性以及RFLP等。这些技术可以反映生物的群体和个体特征，在估测蜜蜂的遗传多样性方面被广泛应用。

1．利用BAPD技术对东方蜜蜂群体结构的分析

RAPD技术可以分析蜜蜂各品种、亚种之间的多态性。早期RAPD—PCR技术被用来检测非洲化蜜蜂和欧洲蜜蜂的DNA，后来科研人员开始用RAPD技术研究东方蜜蜂。黄超群等N利用该技术对中华蜜蜂和意大利蜜蜂基因组DNA进行多态性分析，并找到3条随机引物，用于区别此两种蜜蜂。董霞等对云南及马来西亚的37个东方蜜蜂样本进行了随机扩增多态DNA的分析。但是RAPD技术工作量大且重复性较差，目前在蜜蜂的群体结构方面的研究中未能广泛应用。

2．利用BFLP技术对东方蜜蜂群体结构的分析

线粒体DNA(mtDNA)是线粒体中的遗传物质，其结构较基因组DNA简单。在多数动物品种中mtDNA为母系遗传，因此在有多父系的生物物种间，利用mtDNA分析群体结构更有优势。在蜂群中所有工蜂都是同一只蜂王的后代，所以一只工蜂的mtDNA基因型即可代表一个特定的蜂群，利用mtDNA对蜂群进行研究是一种十分高效、准确的手段。通过对mtDNA的多态性分析，可以了解群体的遗传结构、基因流失及系统发育方面的情况。

目前对蜜蜂线粒体的研究中，RFLP技术发挥着重要作用。其主要方法是利用PCR技术扩增线粒体基因组片段，然后分析其限制酶切位点或序列的差异间。近期对蜜蜂线粒体基因组的研究焦点集中在细胞色素氧化酶C0Ⅰ-C0Ⅱ基因间的序列。在COⅠ-COⅡ之间，有tRNAleu基因和一个非编码区，后者为蜜蜂属所特有。因为它不编码，所以进化速度较快，可为亚种水平上的分析提供信息，蜜蜂线粒体DNA大小的差异主要集中在此非编码区。

线粒体DNA是分析西方蜜蜂亚种间群体差异的有力工具。早在20世纪80年代末和90年代初一线粒体DNA的长度多态性就被用于区分美洲和欧洲的蜜蜂品种。东方蜜蜂和西方蜜蜂同样具有tRNAleu与细胞色素氧化酶亚基COⅡ这一基因间序列，有高含量的A-T碱基，使得东方蜜蜂同样可以利用RFLP技术进行亚种内的线粒体基因类型的检测。Smith等首次对东方蜜蜂线粒体基因型的多态性进行了研究，把东方蜜蜂分成三种类型：亚洲大陆型(分布在日本、泰国、马来西亚、婆罗洲以及印度南部)、吕宋岛类型和安达曼群岛类型。随后，Deowanish等用PCR技术扩增了四种东方蜜蜂亚种的mtDNA的tRNAI-COⅡ基因间序列，并用10种限制性内切酶对日本、中国台湾、越南、泰国、尼泊尔和菲律宾等国家和地区22个地点的27群东方蜜蜂的mtDNA进行分析，把东方蜜蜂分为6种类群，分别分布在(1)日本；(2)尼泊尔、越南和泰国的北部及中部；(3)朝鲜-对马岛；(4)中国台湾；(5)泰国南部；(6)菲律宾。Sihanuntavong等扩增了泰国东方蜜蜂线粒体的srRNA，1rRNA基因以及COⅠ-COⅡ基因的中间区域，在检测的170群蜜蜂中发现了12种线粒体基因类型，在泰国的北部和泰国半岛的东方蜜蜂中检测到比较大的遗传差异。

目前对东方蜜蜂的研究由于研究方法、样品的采集地点和数量不同，分类结果存在诸多争议，比如Ruttner根据形态指标把日本蜜蜂单独划为一个亚种，而通过分子水平的分析Deowanish等认为日本蜜蜂(A.c.japonica)属于尼泊尔、越南及泰国类型，Smith则把日本蜂归入亚洲大陆类型。

综上所述，目前关于东方蜜蜂线粒体DNA的研究大多只测量了一些特定区域的少数样本，而且没有从中国以及喜马拉雅的广大地区收集样品，所以测量结果不足以解释东方蜜蜂群体的系统发育关系。由于已有的研究采用的方法不同，结果没有比较性，所以目前关于东方蜜蜂群体线粒体DNA的研究结果还没有统一的认识。

3．微卫星标记在东方蜜蜂群体多样性方面的应用

由于人们对西方蜜蜂的认识比较深入，很多新技术也首先应用到西方蜜蜂的研究中，Estoup等分析了西方蜜蜂群体中微卫星位点的差异，后来Sittipraneed 从泰国的不同地区收集了蜜蜂样本，用3个微卫星位点分析了东方蜜蜂的群体差异，认为泰国境内由于地理环境的差异，东方蜜蜂群体可以进行种内的再划分。

4．其他方法分析东方蜜蜂的群体多样性

国外学者通过对蜜蜂线粒体DNA的ATPase6基因进行序列分析，对西方蜜蜂的起源、系统分化等问题进行了探讨。王瑞武等扩增、克隆了我国吉林、北京地区的中华蜜蜂线粒体DNA的ATPase6和ATPase8基因，测序后与已发表的序列进行比较，对中华蜜蜂的起源和系统分化进行探讨，目的在于为中华蜜蜂的分类、保护及合理利用提供基础数据，结果提示ATPase6和ASTase8基因在蜜蜂亚种内均属于保守区，在种间有时出现变异。

总之，目前对于西方蜜蜂的研究较为深入，很多新技术和方法都已经得到应用，虽然东方蜜蜂与西方蜜蜂的亲缘最近，但有关东方蜜蜂各亚种的遗传变异方面的研究相对较少，特别是对中国境内的东方蜜蜂的群体多样性的研究基本还停留在形态测量水平上，很少涉及分子技术方面的应用，国内属于空白领域。因此，从分子水平上对我国境内的东方蜜蜂群体多样性进行研究，可以对中华蜜蜂进行更准确的分类，为深入了解我国的蜂种资源和蜂种的保护与利用提供重要依据。

参考文献(略）

引自《中国蜂业》2006（2）

丁桂玲 张秀琳 吕丽萍 石巍

中国农业科学院蜜蜂研究所育种中心