一、花粉形态分析
花粉形态分析与国际生物**合会(IUBS)的国际蜜源植物协会(ICBB)要求一致，采用Louveaux的方法，10 g花粉与50 mL水混合15 min，在分析花粉前取10 mL液体用30 mL水进一步稀释，按照Vergeron的方法用显微镜对花粉粒计数。
二、物化分析
1、总酚和鞣酸
总酚和鞣酸的含量用Marigo法(有部分修正)进行测定，这种方法是基于磷钼酸和磷钨酸酚基团的氧化。5 g细微的花粉样品用75 mL 70％(v/v)的甲醇振荡提取45 min。用Buchner漏斗过滤后，残余物用70％的甲醇冲洗并且将最后的体积稀释到100 mL，测定提取物。PVPP(Polyclar AT，Carlo Erba，Milano，意大利)溶解在pH 3.5的10 mL花粉的甲醇提取溶液中做空白对照。PVPP作为酚类化合物的吸收剂被加人。在760 nm下读取吸光值，分别用5、25、50、100、150和200 mg/kg的没食子酸做标准曲线以测定酚。在pH 4下用含有1％NaCl的10％的凝胶溶液沉淀含水提取物(10 mL)，通过吸光值之差测定鞣酸。
2、黄酮类化合物
测定5g细微花粉样品的总黄酮。在样品中加入1 mL 0.5％的六甲基四胺(w/v)、20 mL丙酮和2 mL 0.1N的HCl，回流30 min，过滤，取滤液，用丙酮定容到100 mL，残余物用20 mL丙酮冲洗。将10 mL的提取液与20 mL水、25 mL的乙酸乙酯置于分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次。提取物用水冲洗两次，每次用水50 mL，随后用乙酸乙酪定容至100 mL。根据德国药典中的方法进行总黄酮的测定，在10 mL提取物中添加1 mL 2％的A1C13的甲醇溶液(在甲醇中添加5％的乙酸)，在425 nm下读取吸光值，以8、16、24和32 mg/kg芦丁制作标准。
3、游离黄酮苷元
HPLC检测游离黄酮苷元。5 g细微的花粉样品溶解于25mL的乙酸乙酯中，然后加入125 mL 40％(NH4)2SO4和250 mL 20％的HPO3，摇动烧瓶20 min，提取物用Buchner漏斗过滤，溶液倒入分液漏斗中，收集上层相，重复提取步骤，有机相收集到100 mL烧瓶中，在40℃以下真空干燥，样品重新溶解在4 mL甲醇中，通过0.45 μm的网眼尼龙过滤并定容至5 mL。依据下列步骤进行HPLC操作：Nucleosil C18柱(10 μm)(4.6 mm×250 mm)；DAD波长278～282和278。350 nm；流动相a，双蒸水，pH 2.6(H3PO4)；流动相b，甲醇；流速2 mL/min；甲醇浓度从0％到100％梯度洗脱33 min；进样量20 μL。色谱柱重平衡10 min。通过外标法定量。
标准曲线是以峰面积对标准品的浓度(香草酸、丁香酸和异鼠李素5～20mdkg；对—香豆酸、邻—香豆酸、4-经基苯酸乙酯(对羟基苯甲酸乙酯)、反式肉桂酸、原儿茶酸、杨梅酮和看莰菲醇，5～100 mg/kg；槲皮素25～250 mg/kg；芦丁100～1000 mg/kg)的线形回归建立，所有的标准曲线都通过原点，相关系数接近1(0.998～0.999)。含有标准品或提取物的溶液一直是避光保存以免降解。每周甲醇中成分的稳定性在375 nm(黄酮醇)和340 nm(黄酮)下进行分光光度检测。
4、酚类化合物的鉴定
采用HPLC鉴定不同的酚类化合物，按照Marham的方法经过羟基化作用、甲基化，与金属整和，利用波长从320～380 nm和从240～280 nm的增色效应及相应标识物的共同色谱分析。采用光谱对照技术比较光谱图，结合光谱图的匹配程度和峰纯度确定化合物。
控制好蜂花粉水分含量很重要，水分决定蜂花粉的微生物特性、感官品质和产品的货架期。除样品4外，游离氨基酸的最低量为2 g/100g，显示该样品适宜的新鲜程度和正确干燥方法。蜂花粉的游离氨基酸含量的下降是因干燥或包装时温度过高，意味着营养下降。脯氨酸与氨基酸总量之比可当作花粉成熟度的指标。除5、7、11号样品之外，新鲜花粉和正确加工的蜂花粉均符合此指标(＜75％)。
用分光光度法测定了多酚和黄酮成分的含量，多酚为1.24±0.20 g/100g，黄酮为0.51±0.16 g/100g。样品不能以鞣酸为指标检测多酚，64％的样品显示出多酚含量的最低值不低于1.20 g/100g。在花粉的采集过程中，蜜蜂阻断α或β-葡(萄)糖苷酶引起糖苷部分酶水解成游离苷元。通过HPLC对游离黄酮苷元进行了定性定量的测定，其平均值为65.05±14.2 mg/100g。不经化学水解，通过气相色谱可判定下述游离糖的存在：葡萄糖、果糖和蔗糖，低比例的二糖：海藻糖、异麦芽糖和麦芽糖，三糖中的棉子糖、erlose和松三糖。一旦蜂花粉被水解(1.2M的HCl，90℃，50％的甲醇水溶液(Y/v)，反应时间为60 min)，可检测到其他的糖(如鼠李糖)，与天然游离苷元（＜95 mg/100g)相比，黄酮化合物的比例相当高(＞600 mg／100g)。
植物花粉含有大量的黄酮醇糖苷，它们存在花粉粒外壁上。酚类化合物的HPLC色谱图不能鉴别水解的和没有经化学水解的蜂花粉样品。我们不能鉴别蜂花粉的植物来源。按照表1和表2所得到的结果，游离类黄酮苷元能用来确定蜂花粉的质量。
多酚氧化酶是一种广泛存在植物中，能催化酚类化合物氧化和聚合成褐色素。乙酸乙酯和甲醇提取可以降低酶的活性。提取时间从30分钟延长到45分钟或样品量由3克增加到5克并没有影响提取效率和降解组分。与其他食品比较，蜂花粉中总多酚的含量偏高。
黄酮苷元与蜂花粉的质量相关，这些化合物的最小值可以作为产品可接受的指标。在最近的研究中，多酚、单宁、类黄酮、儿茶酚、表儿茶酸在鉴定可可粉、水果、蔬菜和加工食品的品质中是关键的指标。蜂花粉黄酮昔元的HPLC色谱图表明有15种组分，这15种化合物中能鉴别出13种。下面是被鉴定的化合物：①安息香酸衍生物(C6-C1)(3，4二羟基苯甲酸，原儿茶酸，4-羟基苯甲酸乙酯，香兰酸，丁香酸)；②羟基肉桂酸(C6-C3)(对香豆酸，正香豆酸，反肉桂酸)；③黄酮醇和黄酮(C6-C3-C6)(芦丁、槲皮素、茨非醇、杨梅酮、异鼠李素)。芦丁(槲皮素糖苷)是最重要的类黄酮糖苷的成分。11种化合物的组分相似，主要含有黄酮醇。方差分析表明11种蜂花粉的多酚、类黄酮化合物的含量有显著性差异(P≤0.05)。在鉴定的酚类化合物中，芦丁有最高的清除ROO-自由基的活性(以摩尔为单位)和人体红血球的光敏水解保护效果。
一般而言，黄酮醇和从叶、种子、水果发现的类黄酮是不错的抗氧化剂。除对肉桂酸以外，蜂花粉的酚酸类(经基肉桂酸和羟基苯甲酸)也都是很好的抗氧化剂。抗氧化活性随着临位二羟基基团的增加而增加。检测芦丁是检验蜂花粉质量的一种方法。芦丁含量较低表明蜂花粉贮藏期长或在干燥过程中加热过度。蜂花粉芦丁含量较高(29±7.98 mg/100g)，从18.35 mg/100g到44.45 mg/100g波动。蜂花粉的质量能从生物活性和营养价值方面给予充分的评价。因而，在欧洲市场上标准化西班牙市场销售的蜂花粉，芦丁最小含量为20 mg/100g。蜂花粉的质量与保存期相关，营养价值和生物活性随着产品质量的不同而不同。
|
